El estrés materno indujo el estrés del retículo endoplásmico y la alteración de la secreción de insulina de los islotes pancreáticos a través de la regulación positiva del receptor de glucocorticoides en crías de ratas macho adultas

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 12552 (2022) Citar este artículo

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La exposición al estrés perinatal (prenatal y/o posnatal) se considera un factor de riesgo de trastornos metabólicos en etapas posteriores de la vida. En consecuencia, este estudio tuvo como objetivo investigar los efectos del estrés perinatal en la inducción del estrés del retículo endoplásmico pancreático (ER), el deterioro de la secreción de insulina y los cambios en la expresión de WFS1 (wolframin ER transmembrane Glycoprotein, que participa en la homeostasis del ER y la secreción de insulina), en crías de rata. De acuerdo al tiempo de exposición de las madres a estrés variable, sus crías machos se dividieron en control (CTRL); estrés previo al embarazo, embarazo y lactancia (PPPLS); estrés previo al embarazo (PPS); estrés del embarazo (PS); estrés de la lactancia (LS); pre-embarazo, estrés del embarazo (PPPS); embarazo, estrés de lactancia (PLS); pre-embarazo, grupos de estrés por lactancia (PPLS). Se extirparon los páncreas de las crías para la extracción de ER y la evaluación de los biomarcadores de estrés de ER, la metilación del ADN del gen WFS1 y la secreción de insulina de los islotes aislados. También se probó la tolerancia a la glucosa. En los grupos estresados, el estrés materno aumentó significativamente los niveles de corticosterona en plasma. En los grupos PPS, PS y PPPS, el estrés materno aumentó los niveles de proteína Bip (Hsp70; miembro 4 de la familia A de proteínas de choque térmico), Chop (Ddit3; transcripto inducible por daño en el ADN3) y WFS1 en el RE extraído del páncreas. Además, la secreción y el contenido de insulina de los islotes junto con la tolerancia a la glucosa se vieron afectados en estos grupos. En los grupos PPS, PS, LS y PPPS, la expresión del receptor pancreático de glucocorticoides (GR) aumentó. El estrés materno no afectó la metilación del ADN WFS1 pancreático. Por lo tanto, el estrés materno, durante el período prenatal, afectó la secreción de insulina de los islotes y la homeostasis de la glucosa en la descendencia masculina adulta, posiblemente a través de la inducción del estrés del RE y la expresión de GR en el páncreas, en este sentido, el papel de la alteración de la proteína WFS1 en el RE pancreático debería también ser considerado.

La alteración de la secreción de insulina de los islotes de Langerhans es una de las principales causas de los trastornos metabólicos asociados con el metabolismo de la glucosa, como la diabetes, que podría deberse a varios factores ambientales, incluido el estrés1. Se pensaba que la prevalencia de los trastornos metabólicos se veía afectada principalmente por factores genéticos; sin embargo, la genética no puede explicar todas las razones que causan los trastornos metabólicos, por lo que investigaciones recientes se han centrado en el estilo de vida como un factor importante en la incidencia de enfermedades metabólicas2. El estrés materno/perinatal se considera un factor de riesgo en términos de consecuencias transgeneracionales. Se refiere a la exposición materna a condiciones estresantes como angustia psicológica y física (p. ej., depresión, ansiedad, dietas altas en carbohidratos y/o grasas) durante la preconcepción, el embarazo y también los períodos de lactancia, que pueden afectar la programación de los órganos en desarrollo de la descendencia, y puede conducir a resultados negativos, como disfunción cardiovascular y diabetes en etapas posteriores de la vida3,4. Los mecanismos críticos propuestos para explicar estas asociaciones son poco conocidos. Los cambios epigenéticos en varios sistemas corporales, inducidos por niveles elevados de glucocorticoides, se han sugerido como un mecanismo potencial que vincula las experiencias adversas durante el período perinatal y la salud deteriorada de la descendencia en etapas posteriores de la vida5. Muchos estudios en humanos y animales han verificado que la exposición perinatal a altos niveles de glucocorticoides puede, directa o indirectamente, cambiar los niveles de expresión de genes 'reguladores epigenéticos' como la ADN metiltransferasa 1 (Dnmt1) en la descendencia, a través de ácidos grasos libres, citoquinas inflamatorias, estrés oxidativo e hiperglucemia6. La alteración de la programación del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal (HPA) de los hijos (y, por lo tanto, de los niveles de glucocorticoides circulantes) puede resultar en una mayor capacidad de respuesta del HPA al estrés en la edad adulta7.

Estudios recientes han demostrado que la metilación del ADN es sensible a la exposición temprana al estrés ambiental. Como prueba, los hijos adultos con antecedentes de abuso y negligencia infantil mostraron ansiedad y disfunción del eje HPA en la edad adulta y estos hijos exhibieron una expresión hipermetilada y reducida de los receptores de glucocorticoides (GR) del hipocampo8. Por el contrario, un mayor cuidado materno posnatal temprano, como comportamientos de lamer y amamantar y amamantar con la espalda arqueada (LG-ABN, por sus siglas en inglés) hacia los cachorros, causó hipometilación y expresión elevada de GR en el hipocampo y redujo las respuestas al estrés9. Además, Nyirenda et al. indicaron que la exposición a glucocorticoides en exceso durante el embarazo y la lactancia tuvo efectos duraderos en la programación de las vías de señalización metabólica que se manifestaron como hiperglucemia, intolerancia a la glucosa y resistencia a la insulina en animales adultos10. Por otra parte, recientemente se ha demostrado que el estrés del retículo endoplásmico (RE) es un mecanismo central implicado en la aparición de enfermedades relacionadas con trastornos metabólicos. La homeostasis del retículo endoplásmico (ER) es crucial para la función adecuada de las células, y un sistema de protección llamado respuesta de proteína desplegada (UPR) se activa como consecuencia de una homeostasis del ER alterada. Este UPR busca aliviar los efectos adversos del estrés del RE mediante la activación de tres vías de señalización: IRE1, PERK y ATF6, que se denominan sensores UPR11,12.

Un estudio ha demostrado que los factores ambientales y genéticos fueron las causas de la inducción del estrés del RE, específicamente en las células β, lo que puede conducir a la reducción de la síntesis y secreción de insulina13. Además, Linssen et al. informaron que el tratamiento con prednisolona podría inducir la activación mediada por GR de las vías IRE1-XBP1 que dieron como resultado la supresión de la biosíntesis y secreción de insulina en las células INS-1E secretoras de insulina14. Otros estudios también han demostrado que una dosis baja de corticosterona podría inducir estrés del RE y elevar los marcadores de estrés del RE (Bip, Chop) a través del GR en macrófagos15 y páncreas16 de ratones C57BL/6 J. Además, ha revelado que WFS1 desempeñó un papel importante en la biosíntesis y secreción de insulina, así como en el mantenimiento de la homeostasis del RE en las células β pancreáticas17. WFS1 es una proteína transmembrana ubicada en el ER y es un componente novedoso de la señalización de estrés del ER18,19,20. En condiciones de estrés del RE, la expresión del gen WFS1 se elevó a través de la proteína de unión a la caja X (XBP1) y mitiga la respuesta al estrés del RE en las células β pancreáticas19. La pérdida de su función provocó un deterioro en la respuesta al estrés del RE y la apoptosis18,21. Varios estudios recientes informaron que las mutaciones en esta proteína aumentaron la glucosa plasmática y redujeron la insulina plasmática22, alteraron la secreción de insulina estimulada por glucosa y el contenido de insulina de los islotes de Langerhans21, disminuyeron la masa de células beta y elevaron la expresión de marcadores de estrés ER23. Dados los efectos de la exposición al estrés y la consiguiente elevación de la corticosterona en la inducción del estrés del RE, y el importante papel de la proteína WFS1 en la modulación de la vía UPR y la biosíntesis y secreción de insulina de las células β, se propuso esta investigación para probar la hipótesis de que la exposición a la insulina materna el estrés durante los períodos previo al embarazo, embarazo y lactancia afectaría la programación de los sistemas involucrados en la homeostasis de la glucosa en crías de ratas macho adultas a través de niveles altos de corticosterona, inducción de estrés en el RE pancreático y/o cambios en la expresión del gen WFS1 pancreático y la metilación del ADN.

El ANOVA bidireccional de medidas repetidas mostró que durante el período anterior al embarazo, después de la primera y la última exposición al estrés, el estrés materno variable aumentó significativamente los niveles de corticosterona en plasma en los grupos PPPLS, PPS, PPPS y PPLS en comparación con el grupo CTRL (P < 0,001). Durante el período de embarazo, después de la primera exposición al estrés, los niveles de corticosterona en plasma materno en los grupos PPPLS, PS, PPPS, PLS y PPLS mostraron elevaciones marcadas (P < 0.001) y también, después de la última exposición al estrés, en los grupos PPPLS, PS, y grupos PLS (P < 0,001) en comparación con el grupo CTRL (Fig. 1A).

Efecto del estrés perinatal sobre los niveles de corticosterona de la descendencia materna (A) y masculina (B). Cada columna representa la media ± SEM (6 ratas/grupo, 6 litros/grupo). Los datos se analizaron utilizando ANOVA de medidas repetidas de dos vías seguido de la prueba post hoc de Tukey. Los análisis se realizaron en cada categoría por separado; **P < 0,01, ***P < 0,001 frente al grupo CTRL; ###P < 0,001 frente al grupo PPS; φφφP < 0,001 frente al grupo PPPS; ɛɛɛP < 0,001 frente al grupo PLS; δδδP < 0,001 frente al grupo PPLS. CTRL sin estrés, PPPLS antes del embarazo, embarazo, estrés por lactancia, PPS estrés antes del embarazo, PS estrés por embarazo, LS estrés por lactancia, PPPS antes del embarazo, estrés por embarazo, PLS embarazo, estrés por lactancia, PPLS antes del embarazo, estrés por lactancia.

Sin embargo, el ANOVA de medidas repetidas bidireccionales mostró que en PND-1 hubo un aumento significativo en los niveles de corticosterona en plasma de la descendencia en los grupos LS (P < 0,001) y PPLS (P < 0,01) en comparación con el grupo CTRL; no se observaron cambios en los niveles de corticosterona en plasma de los hijos de otros grupos de estudio en comparación con el grupo CTRL. En PND-21, los niveles de corticosterona en plasma de la descendencia mostraron una elevación significativa en los grupos PPPLS, PS, LS y PPLS en comparación con el grupo CTRL (P < 0,001). Además, en PND-64, los niveles de corticosterona en plasma de la descendencia en los grupos PPPLS, PS, LS, PPPS, PPLS (P < 0.001) y PLS (P < 0.01) mostraron un incremento significativo en comparación con el grupo CTRL (Fig. 1B).

Los niveles de glucosa en plasma mostraron una disminución significativa en los grupos PPPLS (P < 0.05), PPS y PPLS (P < 0.01) PS (P < 0.001) en comparación con el grupo CTRL en condiciones de ayuno (0 min). Después de la carga de glucosa, los niveles plasmáticos de glucosa se elevaron en el tiempo 30, y estos niveles en el grupo PS fueron significativamente más altos que los del grupo CTRL (P < 0,001), luego los valores comenzaron a descender en todos los grupos de estudio; sin embargo, los niveles de glucosa en plasma a los 60 min fueron significativamente más altos en los grupos PPPLS, PS (P < 0,001) y PPPS (P < 0,05) que en el grupo CTRL (Fig. 2A). El área bajo la curva (AUC) de los niveles de glucosa en plasma en el grupo PS mostró que los niveles de glucosa en plasma aumentaron significativamente en comparación con el grupo CTRL. Estos datos indican que el aclaramiento de glucosa en el grupo PS fue significativamente menor en comparación con el grupo CTRL (P < 0,001, Fig. 2B).

Efecto del estrés perinatal sobre el nivel de glucosa plasmática (A) y el AUC (B), el nivel de insulina plasmática (C) y el AUC (D) durante la SOG en crías masculinas adultas jóvenes. Cada punto y columna representan la media ± SEM (n = 6 ratas/grupo, 6 litros/grupo); Los datos se analizaron utilizando ANOVA de medidas repetidas de dos vías seguido de la prueba post hoc de Tukey; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 frente al grupo CTRL; $$P < 0,01 frente al grupo PS; ooP < 0,01, oooP < 0,001 frente al grupo LS; φφP < 0,01 frente al grupo PPPS; ɛɛɛP < 0,001 frente al grupo PLS. CTRL sin estrés, PPPLS antes del embarazo, embarazo, estrés por lactancia, PPS estrés antes del embarazo, PS estrés por embarazo, LS estrés por lactancia, PPPS antes del embarazo, estrés por embarazo, PLS embarazo, estrés por lactancia, PPLS antes del embarazo, estrés por lactancia.

Los niveles de insulina plasmática aumentaron significativamente en los grupos PPPLS, PLS (P < 0,001) y PPLS (P < 0,01) en comparación con el grupo CTRL en ayunas (0 min). Los valores se elevaron y alcanzaron un pico después de 30 min de carga de glucosa y se acercaron a los del tiempo cero dentro de los 120 min. Los niveles de insulina plasmática en el minuto 30 en todos los grupos de estrés, excepto en el grupo PS y PPS, fueron más altos que los del grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,01). Este parámetro en el minuto 60 en los grupos PPPLS, PLS (P < 0,001) y PPLS (P < 0,01) fue mayor que el del grupo CTRL. Los niveles de insulina en plasma al minuto 120 en todos los grupos de estrés mostraron un marcado incremento en comparación con el grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,05, Fig. 2C). El área bajo la curva (AUC) de los niveles de insulina en plasma en los grupos PPPLS, PLS y PPLS mostró que los niveles de insulina en plasma aumentaron significativamente en comparación con el grupo CTRL. Estos resultados sugieren que estos grupos pueden ser más eficientes para eliminar la carga de glucosa (P < 0,001, Fig. 2D).

Como se muestra en la Fig. 3A, el índice HOMA-IR se elevó notablemente en los grupos PPPLS y PLS en comparación con el grupo CTRL (P < 0,001). No hubo diferencias significativas en relación a este índice en otros grupos de estrés en comparación con el grupo CTRL, sin embargo; El índice HOMA-IR en el grupo PPPLS aumentó significativamente en comparación con los grupos PPPS (P < 0,05). Además, este índice en el grupo PLS se elevó significativamente en comparación con el grupo PS (P < 0,01, Fig. 3A).

Efecto del estrés perinatal sobre el HOMA-IR (A) y el índice de Matsuda (B) en descendencia masculina adulta joven. Cada columna representa la media ± SEM (6 ratas/grupo, 6 litros/grupo); Los datos se analizaron usando ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey; **P < 0,01, ***P < 0,001 frente al grupo CTRL; ++P < 0,01, +++P < 0,001 frente al grupo PPPLS; $$P < 0,01 frente al grupo PS; φP < 0,05 frente al grupo PPPS; ɛP < 0,05 frente al grupo PLS; δP < 0,05 frente al grupo PPLS. CTRL sin estrés, PPPLS antes del embarazo, embarazo, estrés por lactancia, PPS estrés antes del embarazo, PS estrés por embarazo, LS estrés por lactancia, PPPS antes del embarazo, estrés por embarazo, PLS embarazo, estrés por lactancia, PPLS antes del embarazo, estrés por lactancia.

Se observó una disminución significativa en el índice de Matsuda en todos los grupos de estrés en comparación con el grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,01). Además, hubo una reducción significativa de este índice en el grupo PPPLS en comparación con los grupos PPPS y LS (P < 0,001 a P < 0,01). Por otro lado, el índice de Matsuda en los grupos PPS, PS y LS fue significativamente mayor que el de los grupos PPL y PLS (P < 0.05, Fig. 3B).

En todos los grupos de estudio, la secreción de insulina de los islotes aislados en presencia de glucosa 16,7 mM fue superior a la concentración de glucosa 5,6 mM. La secreción de insulina basal después de la incubación en glucosa 5,6 mM en los grupos PPPLS, PLS y PPLS fue significativamente mayor que la del grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,01). Además, la secreción de insulina en el grupo PPPLS en presencia de una concentración de glucosa de 5,6 mM fue mayor que la de los grupos LS y PPPS (P < 0,001). Las respuestas a glucosa 5,6 mM en los grupos PLS y PPLS también fueron significativamente más altas que las de los grupos PS y PPS respectivamente (P < 0,01, Fig. 4A).

Efecto del estrés perinatal sobre la secreción de insulina de los islotes aislados (A,B) y el contenido de insulina (C,D) en respuesta a concentraciones de glucosa de 5,6 mM y 16,7 mM en la descendencia masculina adulta joven. Cada columna representa la media ± SEM (4 ratas/grupo, 4 litros/grupo). Los datos se analizaron usando ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey; **P < 0,01, ***P < 0,001 frente al grupo CTRL; ##P < 0,01 frente al grupo PPS; $$P < 0,01, $$$P < 0,001 frente al grupo PS; ooP < 0,01, oooP < 0,001 frente al grupo LS; φφφP < 0,001 frente al grupo PPPS. CTRL sin estrés, PPPLS antes del embarazo, embarazo, estrés por lactancia, PPS estrés antes del embarazo, PS estrés por embarazo, LS estrés por lactancia, PPPS antes del embarazo, estrés por embarazo, PLS embarazo, estrés por lactancia, PPLS antes del embarazo, estrés por lactancia.

Cuando los islotes se estimularon con una concentración de glucosa de 16,7 mM, se observó un aumento significativo en la secreción de insulina en los grupos PPPLS, PLS y PPLS en comparación con el grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,01). Hubo un aumento significativo de la secreción de insulina en el grupo PPPLS en presencia de una concentración de glucosa de 16,7 mM en comparación con los grupos LS y PPPS (P < 0,001). Además, la secreción de insulina en presencia de una concentración de glucosa de 16,7 mM en el grupo PLS fue significativamente mayor que la de los grupos PS y LS (P < 0,001, Fig. 4B).

El contenido de insulina de los islotes aislados en respuesta a la concentración de glucosa 5,6 mM mostró aumentos significativos en los grupos PPPLS, PLS y PPLS en comparación con el grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,01). Se observó una elevación significativa del contenido de insulina de los islotes en el grupo PPPLS en presencia de una concentración de glucosa de 5,6 mM en comparación con los grupos PPPS y LS (P < 0,001 a P < 0,01). Además, hubo un aumento significativo del contenido de insulina de los islotes en el grupo PLS en presencia de una concentración de glucosa de 5,6 mM en comparación con el grupo PS (P < 0,001, Fig. 4C).

Además, después de la estimulación con glucosa 16,7 mM, hubo un aumento significativo en el contenido de insulina de los islotes aislados en los grupos PPPLS, PLS y PPLS en comparación con el grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,01). Sin embargo, este parámetro en presencia de una concentración de glucosa de 16,7 mM en el grupo PPPLS fue significativamente mayor que el de los grupos LS (P <0,01, Fig. 4D).

El análisis estadístico reveló que la expresión de ARNm de Bip aumentó en el tejido pancreático de los grupos PPPLS, LS y PPLS, PPS, PLS, PS y PPPS en comparación con el grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,05). Los niveles de expresión de ARNm de Bip en los grupos PPPS fueron significativamente más altos que los del grupo PPPLS (P < 0,01); sin embargo, la expresión de ARNm de Bip en el grupo PLS se redujo en comparación con el grupo PS (P <0,05, Fig. 5A).

Efecto del estrés perinatal en el tejido pancreático Bip (A), Chop (B) y la expresión de ARNm de WFS1 (C) y los niveles de ER extraídos del páncreas de Bip (D,E), Chop (D,F) y WFS1 (D,G) Proteínas en descendencia masculina adulta joven. Las cifras representativas de la RT-PCR muestran el cambio de veces (3 ratas/grupo, 3 litros/grupo) y las bandas representativas muestran los respectivos valores densitométricos (8 ratas/grupo, 8 litros/grupo). Veinte μg de proteínas se separaron en SDS-PAGE, se sometieron a transferencia Western, se sondaron con anticuerpos anti-Bip, anticuerpos anti-Chop y anticuerpos anti-WFS1 y se reprobaron con anticuerpos anti-Calnexin (D) Se miden las densidades de las bandas de proteínas y se se calcula la relación (E–G). Cada columna representa la media ± SEM. Los datos se analizaron usando ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 frente al grupo CTRL; +P < 0,05, ++P < 0,01, +++P < 0,001 frente al grupo PPPLS; ɛP < 0,05, ɛɛP < 0,01 frente al grupo PLS; δP < 0,05, δδP < 0,01 frente al grupo PPLS. CTRL sin estrés, PPPLS antes del embarazo, embarazo, estrés por lactancia, PPS estrés antes del embarazo, PS estrés por embarazo, LS estrés por lactancia, PPPS antes del embarazo, estrés por embarazo, PLS embarazo, estrés por lactancia, PPLS antes del embarazo, estrés por lactancia.

En el RE extraído del páncreas, el nivel de proteína Bip en todos los grupos de estrés, excepto PPPLS, fue significativamente mayor que el del grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,05). Además, este parámetro en los grupos PPPS fue significativamente mayor que el del grupo PPPLS (P < 0,001). Hubo diferencias significativas entre los niveles de proteína Bip en el RE pancreático de los grupos PPS y PS en comparación con los de los grupos PPLS y PLS respectivamente (P < 0,01 a P < 0,05, Fig. 5D,E).

Según el análisis ANOVA, los niveles de expresión del ARNm de Chop pancreático en todos los grupos de estrés, excepto los grupos PPPLS y PPLS, fueron significativamente elevados en comparación con el grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,05). Además, los niveles de expresión de ARNm de Chop en los grupos PPPS fueron significativamente más altos que los del grupo PPPLS (P < 0,001). Este parámetro en el grupo PS aumentó en comparación con el grupo PLS (P < 0,05, Fig. 5B).

Los niveles de proteína Chop en el RE extraído del páncreas de los grupos PPS, LS, PLS, PS y PPPS fueron significativamente más altos que los de CTRL (P < 0,001 a P < 0,05); sin embargo, no hubo diferencias significativas entre los niveles de proteína Chop pancreática de los grupos PPPLS, PPLS y CTRL. Chop nivel de proteína en el páncreas del grupo PS aumentó significativamente en comparación con los de los grupos PLS (P <0,05). Este parámetro en el grupo PPPS se elevó en comparación con los de los grupos PPPLS (P <0.001, Fig. 5D, F).

El análisis estadístico reveló que el nivel de ARNm de WFS1 pancreático en todos los grupos de estrés aumentó significativamente en comparación con el grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,05). La expresión de ARNm de WFS1 en el páncreas de los grupos PPPS fue significativamente mayor que la del grupo PPPLS (P < 0,05). Este parámetro en el grupo PS también se elevó en comparación con el grupo PLS (P <0.01, Fig. 5C).

En el RE extraído del páncreas, el nivel de proteína WFS1 en todos los grupos de estrés, excepto los grupos PPPLS y PPLS, fue significativamente mayor que el del grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,05). Este parámetro en los grupos PPPS se elevó significativamente en comparación con el grupo PPPLS (P < 0,001). Además, el nivel de proteína WFS1 en el ER extraído del páncreas de los grupos PPS y PS aumentó significativamente en comparación con los de los grupos PPLS y PLS respectivamente (P <0.01, Fig. 5D, G).

La expresión de GR mRNA en el tejido pancreático de los grupos PPS, PS, PPPS y LS aumentó significativamente en comparación con la del grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,05). Este parámetro en los grupos PPPS fue significativamente mayor que el del grupo PPPLS (P < 0,001). La expresión de ARNm de GR pancreático en los grupos PPS y PS aumentó significativamente en comparación con los grupos PPLS y PLS respectivamente (P < 0,01 a P < 0,05, Fig. 6A).

Efecto del estrés perinatal sobre los niveles de proteína GR (A) pancreática (B, C) en la descendencia masculina adulta joven. Cada columna representa la media ± SEM (3 ratas/grupo, 3 litros/grupo). Los datos se analizaron usando ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 frente al grupo CTRL; +++P < 0,001 frente al grupo PPPLS; ɛɛP < 0,01 frente al grupo PLS; δP < 0,05, δδP < 0,01 frente al grupo PPLS. CTRL sin estrés, PPPLS antes del embarazo, embarazo, estrés por lactancia, PPS estrés antes del embarazo, PS estrés por embarazo, LS estrés por lactancia, PPPS antes del embarazo, estrés por embarazo, PLS embarazo, estrés por lactancia, PPLS antes del embarazo, estrés por lactancia.

El análisis estadístico reveló que la proteína GR de los grupos PPPS, PS, LS y PPS se elevó significativamente en comparación con el grupo CTRL (P < 0,001 a P < 0,05). Este valor en los grupos PPPS fue significativamente mayor que el del grupo PPPLS (P < 0,001). Además, este parámetro en los grupos PPS aumentó en comparación con el del grupo PPLS (P <0.01, Fig. 6B, C).

Como se muestra en la Fig. 7A-C, no hubo cambios significativos en los niveles de metilación del gen WFS1 en el páncreas de diferentes grupos.

Efecto del estrés perinatal sobre la metilación del ADN del gen WFS1 en tejido pancreático. Presentación esquemática del área promotora del gen WFS1 que abarca la isla CpG investigada (A). Electroforesis en gel de agarosa que demuestra el estado de metilación del promotor WFS1 en tejido pancreático mediante PCR específica de metilación (MSP). Los conjuntos de cebadores utilizados para la amplificación se designan como no metilados (U) y metilados (M) (B). Cada columna representa la media ± SEM (3 ratas/grupo, 3 litros/grupo). CTRL sin estrés, PPPLS antes del embarazo, embarazo, estrés por lactancia, PPS estrés antes del embarazo, PS estrés por embarazo, LS estrés por lactancia, PPPS antes del embarazo, estrés por embarazo, PLS embarazo, estrés por lactancia, PPLS antes del embarazo, estrés por lactancia.

El presente estudio evaluó la hipótesis de que la exposición a niveles altos de corticosterona inducidos por el estrés perinatal podría afectar la programación de los sistemas metabólicos en la descendencia. Los hallazgos de esta investigación demostraron que la descendencia que se expuso al estrés prenatal junto con el postnatal (en los grupos PPPLS, PLS, PPLS y LS) mostró un aumento marginal del ARNm del tejido pancreático y los niveles de proteína ER extraída del páncreas de Bip, Chop y WFS1. Mientras que mostraron un marcado aumento de la secreción y el contenido de insulina de los islotes aislados. Por otro lado, a pesar del fuerte incremento del ARNm del tejido pancreático y los niveles de proteína del RE extraída del páncreas de Bip, Chop y WFS1, no hubo cambios significativos en la secreción de insulina y el contenido de islotes aislados en la descendencia que solo se expuso al estrés prenatal (en grupos PPS, PS y PPPS). Además, la exposición al estrés prenatal o posnatal (es decir, en los grupos PPS, PS, LS y PPPS) aumentó la expresión de ARNm y los niveles de proteína de GR en el tejido pancreático. Curiosamente, demostramos por primera vez que la metilación del ADN del gen WFS1 no cambió en la descendencia de ratas adultas de los grupos estresados. Además, el estrés materno afectó la tolerancia a la glucosa y aumentó significativamente los niveles de corticosterona e insulina en plasma basal, así como el índice HOMA-IR; sin embargo, disminuyó el ISI Matsuda (Fig. 8).

Resumen de la conclusión.

En el estudio actual, los niveles basales de corticosterona en plasma en el primer y último día de exposición a estrés variable durante los períodos perinatales aumentaron significativamente en las madres de los grupos estresados; por lo tanto, pudimos examinar el efecto de cada período de estrés solo o en combinación sobre el metabolismo de la glucosa en la descendencia. De manera similar a nuestros resultados, la multiplicidad de factores estresantes utilizados en este estudio no condujo a una adaptación de la respuesta a la corticosterona en las madres que se expusieron repetidamente al estrés24; sin embargo, algunos estudios han informado niveles reducidos de corticosterona en plasma después del estrés materno en madres25. Se considera que los diferentes niveles de corticosterona plasmática podrían estar relacionados con la alternancia de la sensibilidad del eje HPA inducida por la exposición a estrés repetido. En los descendientes de los grupos estresados, excepto los grupos LS y PPLS, el nivel de corticosterona en plasma en PND1 no cambió; sin embargo, aumentó en PND21 en comparación con la descendencia de control. Por el contrario, los estudios demostraron que la exposición durante 24 h a un estrés sonoro en los días 10 a 18 de gestación resultó en una reducción no significativa del nivel de corticosterona basal en ratones C57Bl/6 en PND126. Brummelte et al. informaron que la inyección de corticosterona exógena durante el embarazo (días 10 a 20 de gestación) y posparto (días 2 a 21) aumentó los niveles de corticosterona sérica en PND1, pero no afectó sus niveles en PND21 en crías de ratas27. Estas diferencias entre los estudios pueden deberse a varios mecanismos posibles. En este sentido, los investigadores demostraron que el acceso del feto a la corticosterona materna es bajo debido a la acción de la enzima placentaria 11β-HSD2, que transforma la corticosterona materna en cortisona inactiva, pero esta barrera puede debilitarse aún más por el estrés materno27. Los niveles de globulina fijadora de corticosterona (CBG) en plasma materno también pueden desempeñar un papel en la regulación de los niveles de corticosterona en plasma disponibles para el feto, y el estrés prenatal puede disminuir los niveles de CBG maternos28. Estudios previos indicaron que la CRH materna liberada por el hipotálamo durante el estrés podría transferirse a través de la placenta y activar el eje HPA en las crías de ratas29. Por otro lado, el aumento de los niveles de catecolaminas maternas podría conducir a la vasoconstricción inducida por hipoxia de los vasos placentarios30, lo que a su vez activaría el eje HPA fetal. Según los estudios mencionados anteriormente, la exposición al estrés perinatal podría aumentar la transferencia de corticosteroides maternos directa o indirectamente a través de la placenta al feto. Por lo tanto, es posible que la descendencia se haya adaptado al estrés, lo que podría explicar los niveles plasmáticos de corticosterona sin cambios en PND1. El aumento en el nivel de corticosterona sérica en PND21 podría deberse, al menos parcialmente, a una transferencia directa de corticosterona materna a la descendencia a través de la leche. Los niveles basales de corticosterona en la descendencia adulta de los grupos de estrés, excepto el grupo PPS, fueron más altos que los de los controles. A este respecto, los estudios en animales indicaron que la exposición al estrés por ruido prenatal asociado con estresores físicos en los días 12 a 16 de gestación en los ratones C57BL/6 causó la elevación de la función del eje HPA en la descendencia31. Varios estudios en animales han demostrado que la inducción del estrés prenatal en la descendencia mediante la exposición materna al estrés crónico impredecible (CUMS) durante el embarazo24 y la inyección de corticosterona a las madres adrenalectomizadas durante el período prenatal32 podría aumentar la actividad del eje HPA y los niveles de corticosterona en plasma en la descendencia de ratas . Además, un estudio más reciente indicó que exponer a las madres al estrés crónico de la derrota social (CSDS) antes del embarazo (estresores previos a la concepción) durante 3 semanas activó el eje HPA y aumentó los niveles basales de corticosterona en su descendencia adulta33. En conjunto, estos resultados sugieren que la exposición a corticosterona materna alta durante el período perinatal probablemente afecte la programación del eje HPA en la descendencia, que depende del tipo de factor estresante, la intensidad del estrés, el tiempo y/o la duración de la exposición al estrés, así como la edad de descendencia en el estudio.

Nuestros resultados demostraron que la descendencia materna expuesta al estrés había aumentado los niveles de insulina plasmática y la resistencia a la insulina (índice HOMA-IR) y había disminuido los niveles de glucosa plasmática y la sensibilidad a la insulina (índice Matsuda) en la edad adulta. Los estudios informaron que la exposición al estrés psicológico durante el embarazo en humanos34 y el estrés crónico leve e impredecible durante la última semana de embarazo elevaron los niveles de corticosterona en plasma y el índice HOMA-IR en crías de ratas35. Investigaciones anteriores en animales mostraron que la exposición materna al cortisol (0,48 mg/h) durante el embarazo temprano no alteró la sensibilidad a la insulina en crías de ovejas macho adultas36. Además, Karbaschi et al. demostraron que la dieta materna alta en grasas como factor de estrés psicofísico durante el embarazo y los períodos de lactancia aumentó los niveles de corticosterona en plasma y la sensibilidad a la insulina en crías de ratas adultas37. En general, el estrés materno y la exposición a niveles elevados de corticosterona en plasma en diferentes modelos pueden programar la resistencia a la insulina y la sensibilidad a la insulina en la descendencia, lo que puede atribuirse a alteraciones en la vía de señalización del receptor de insulina en los tejidos periféricos. Por ejemplo, los hijos expuestos al estrés materno mostraron una expresión reducida del receptor de insulina (INSR) y el sustrato del receptor de insulina 1 (IRS1)38, los niveles de proteína AKT (formas total y activada/fosforilada)39, la expresión y/o translocación de Glut4 en el músculo , hígado y tejido adiposo40, que fueron los mecanismos de captación y utilización de la glucosa insulinodependiente. Por lo tanto, era posible que el estrés perinatal pudiera alterar los índices HOMA-IR e ISI al interferir con estas vías mencionadas.

Nuestros hallazgos indicaron que aunque el estrés materno puede afectar la homeostasis de la glucosa-insulina en la edad adulta, la carga de glucosa podría mejorar la glucemia (excepto en el grupo de PS) durante el período perinatal. En línea con nuestros resultados, Blasio et al. informaron que la exposición a un exceso de glucocorticoides maternos en el período temprano del embarazo provocó hiperinsulinemia y mejoró la tolerancia a la glucosa en crías de ovejas macho adultas36. Por el contrario, las crías de ratas macho adultas cuyas madres estuvieron expuestas a estrés social durante el final del embarazo mostraron concentraciones plasmáticas de glucosa o insulina sin cambios después de la prueba de tolerancia a la glucosa41. Por otro lado, los estudios han revelado que la exposición a la dexametasona10, así como la administración de carbenoxolona como inhibidor de la 11 beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 2 (11β-HSD2) placentaria durante el embarazo resultó en hiperglucemia, hiperinsulinemia y alteración de la tolerancia a la glucosa en 6- descendencia de rata de meses42. Por lo tanto, era posible que la alteración de la homeostasis de la glucosa-insulina en la descendencia adulta del presente estudio se debiera en parte a la programación de las vías de señalización de la insulina por un entorno materno adverso y niveles excesivos de corticosterona. El aumento de la secreción de insulina refleja un mecanismo compensatorio de la resistencia a la insulina observada que puede explicar la mejora de la tolerancia a la glucosa en la descendencia43. Además, en el grupo PS se vio afectada la tolerancia a la glucosa, posiblemente debido a una alteración de la secreción de insulina estimulada por la glucosa.

En el estudio actual, hubo una elevación significativa en los niveles de proteína y ARNm de GR pancreático de la descendencia adulta que se expuso al estrés prenatal o posnatal (es decir, en los grupos PPS, PS, LS y PPPS), mientras que no se observaron cambios en la descendencia de madres expuestas. al estrés prenatal más postnatal (es decir, grupos PPPLS, PLS y PPLS). Hasta donde sabemos, no hay estudios en el tema de los efectos del estrés perinatal en la expresión de GR en el tejido pancreático. Sin embargo, los estudios en animales han revelado que la administración prenatal de dexametasona en la última semana de embarazo aumentó44 o disminuyó45 la expresión del ARNm de GR y los niveles de proteína en el hígado, los músculos y los tejidos adiposos en la descendencia adulta. En otro estudio en crías de ratones, la exposición materna al estrés por inmovilización durante el embarazo elevó la expresión del gen GR y los niveles de proteína en el tejido hepático46. Por el contrario, Brunton et al. expuso a las madres de ratas a ratas agresivas como un estrés psicosocial durante el último período de gestación e informó una reducción de la expresión de ARNm de GR en el tejido muscular en su descendencia adulta41. Los estudios mencionados anteriormente mostraron que los niveles de expresión de GR en diferentes tejidos periféricos se vieron alterados por un entorno materno adverso. Parece que la exposición a un cuidado postnatal excesivo (período LS) podría dar como resultado un aumento de la expresión de proteína y ARNm de GR en los grupos PPS, PS, LS y PPPS. Al respecto, estudios indican que el nivel de expresión de GR es afectado por el nivel de cuidado materno47. Por otro lado, hallazgos recientes han sugerido la participación de modificaciones epigenéticas (metilación/desmetilación), que fueron inducidas por un entorno adverso en la vida temprana en los promotores específicos del gen GR. Estas modificaciones epigenéticas podrían cambiar permanentemente la programación de la expresión del gen GR48. Sin embargo, no evaluamos la programación epigenética de GR en el páncreas de la descendencia en esta investigación.

Nuestro estudio también indicó que la descendencia que se expuso al estrés prenatal (es decir, en los grupos PPS, PS y PPPS) tuvo un marcado incremento en los niveles de proteína y ARNm de Bip, Chop y WFS1 tanto en el tejido pancreático como en su ER extraído, pero no se observaron cambios en secreción de insulina y contenido de insulina de los islotes pancreáticos aislados en respuesta a concentraciones de glucosa basales (5,6 mM) y altas (16,7 mM) en estos grupos. Por otro lado, la descendencia que se expuso a estrés prenatal y postnatal (es decir, en los grupos PPPLS, PLS, PPLS y LS) tuvo un aumento marginal de los niveles de proteína Bip, Chop y WFS1 en el RE extraído del páncreas y estos cambios fueron acompañados por la aumento de la secreción de insulina y del contenido de insulina de los islotes pancreáticos aislados en respuesta a concentraciones basales y altas de glucosa. El estudio reciente ha determinado que la exposición breve a dosis bajas de corticosterona endógena en ratones C57BL6 de 12 semanas de edad causó estrés en el RE a través del receptor de glucocorticoides y aumentó directamente los niveles de Bip, XBP1 y ATF6 tanto en los niveles de ARNm como de proteína en las células de macrófagos, mientras que una exposición más prolongada a una dosis más alta no afectó la función de los macrófagos15. Otro estudio mostró que la exposición a la prednisolona indujo un deterioro mediado por GR en la homeostasis del ER que condujo a una mayor activación de las vías de señalización UPR, inhibición de la biosíntesis de insulina y secreción de insulina estimulada por glucosa en las células INS-1E14. El estudio anterior informó que WFS1 es una proteína incrustada en la membrana de ER, que puede regularse bajo estrés de ER y también desempeña un papel esencial en la expresión y secreción de insulina. Por ejemplo, un estudio informó que la exposición a inductores de estrés del RE (tapsigargina y ditiotreitol) provocó la elevación de los niveles de proteína y ARNm de WFS1 en la línea de células β de ratón, células MIN649. Un estudio reciente de Damien Abreu mostró que los defectos de WFS1 in vivo e in vitro provocaron estrés en el RE y redujeron la secreción y el contenido de insulina en respuesta a la glucosa, y desencadenaron el eje Chop-Trib3 en ratones con WFS1 inactivo50. Según los hallazgos mencionados anteriormente, la mayoría de los estudios sobre marcadores de estrés ER se han realizado en líneas celulares humanas y animales y también se han realizado estudios del gen WFS1 principalmente en modelos animales inactivados. En nuestro estudio, por primera vez, la función de WFS1 y UPR en la descendencia se examinó específicamente en el RE extraído del páncreas. Nuestros resultados mostraron que la exposición al estrés materno puede conducir a un nivel de expresión de WFS1 deteriorado y su función como regulador de la actividad de los canales de calcio ER en la descendencia, lo que puede ser la causa de la secreción de insulina y el deterioro del contenido de insulina en la edad adulta. De acuerdo con estos hallazgos, Kakiuch informó que WFS1 forma un complejo con la proteína 94 regulada por glucosa (GRP94) de la chaperona ER en las células neuronales. Por lo tanto, la regulación a la baja de GRP94 puede aumentar la cantidad de WFS1 libre de GRP94, lo que conduce a la mejora de la función WFS151. Los estudios en humanos y modelos animales han demostrado que la exposición materna a glucocorticoides sintéticos durante el embarazo podría provocar alteraciones epigenéticas en el ADN de la descendencia que se tradujo en cambios de programación y efectos duraderos en la expresión de algunos genes52. Por lo tanto, en el presente estudio, es posible que el estrés perinatal haya causado cambios epigenéticos en la vía de señalización UPR en los islotes pancreáticos descendientes, lo que requiere más investigación. Sin embargo, en el estudio actual, por primera vez, se evaluó el efecto de la exposición perinatal al estrés en la metilación de las islas CpG en las regiones promotoras del gen WFS1. Los resultados mostraron que el estrés perinatal no afectó el nivel de metilación del ADN del gen WFS1 en diferentes grupos de estudio. Ahora existe amplia evidencia de que parte de los efectos de las experiencias adversas en el período crítico de la vida alteran la expresión del gen de la corticosterona47. Por lo tanto, parece que en los grupos PPS, PS y PPPS, los niveles elevados de corticosterona plasmática y la expresión pancreática de ARNm y proteína de GR podrían contribuir al deterioro de la homeostasis del ER mediado por GR, por lo que el complejo entre WFS1 y la chaperona ER probablemente se hizo más fuerte y WFS1 permaneció en la sala de emergencias para mantener o restaurar la homeostasis de la sala de emergencias, lo que provocó alteraciones en el metabolismo de la glucosa en estos grupos estresados. El análisis histológico a nivel tisular reveló que WFS1 se expresaba no solo en el RE sino también en los gránulos secretores para regular la acidificación y la maduración de la proteína insulina en las células β pancreáticas de ratón53.

En este estudio, las presas fueron inevitablemente privadas de agua y alimentos durante la exposición al estrés (durante 60 min). Cabe señalar que la privación de agua y alimentos también se considera como un estresor y en muchos estudios que utilizan el paradigma de estrés variable, se considera como uno de los estresores54,55. Como se mencionó anteriormente, la privación de agua y alimentos es un tema inevitable en nuestro estudio. Sin embargo, considerando que los animales estuvieron expuestos a estrés durante la fase de luz, en la que los animales no están activos en cuanto a la alimentación56, y también considerando que este tipo de estresor tiene un aspecto psicológico, como otros tipos de estresores utilizados en este estudio, el agua y la privación de alimentos puede no tener un efecto negativo profundo en los resultados. Además, según estudios previos, desde el destete, las crías machos se alojaron en grupos del mismo sexo de tres animales por jaula hasta el final del experimento57, por lo que se estableció un estado de adaptación entre los animales rata y con el seguimiento del comportamiento de los animales, no hubo estado de dominancia en las ratas que afectara a los resultados del estudio; además, la ingesta de alimentos se midió calculando la diferencia entre la cantidad fija de alimentos y la cantidad restante después de 24 h. esta cantidad luego se dividió por 3 y se consideró como la ingesta de alimentos para cada animal porque no hubo una diferencia significativa entre el peso corporal de los animales, por lo tanto, el efecto de la competencia alimentaria entre animales sobre los cambios metabólicos puede ser débil. Con base en los resultados del presente estudio, parece que el probable incremento del cuidado materno durante la lactancia podría reducir los efectos del estrés materno en la descendencia58,59, por lo tanto, los cambios relacionados con el estrés en los sistemas metabólicos de la descendencia se observaron principalmente durante el período previo al embarazo. y períodos de embarazo. Estos resultados mostraron el efecto del cuidado materno sobre el nivel de expresión génica en los sistemas metabólico y neuroendocrino de la descendencia, lo que requiere mayor investigación9,60,61. Los datos del presente estudio brindan nuevos conocimientos sobre los efectos de WFS1 en la homeostasis de la glucosa-insulina, particularmente en el contexto del estrés durante los períodos críticos del desarrollo; por lo tanto, estos hallazgos brindan motivación para realizar más estudios de investigación y también enfoques terapéuticos dirigidos a WFS1 como tratamiento para trastornos metabólicos relacionados con el estrés en la vejez.

Los hallazgos de la investigación actual mostraron que el estrés materno prenatal afectó el metabolismo de la glucosa en la descendencia de ratas macho adultas a través de la inducción del estrés de ER y el aumento de la expresión de GR pancreático, así como el aumento de la expresión de la proteína ER WFS1 extraída del páncreas. Lo que, a su vez, condujo al deterioro de la secreción de insulina estimulada por la glucosa y el contenido de insulina. Estas alteraciones parecen ser respuestas compensatorias para preservar la homeostasis del RE.

Con base en los resultados de este estudio, se hacen las siguientes sugerencias: investigar los cambios epigenéticos del receptor de glucocorticoides en el tejido pancreático, evaluar el nivel de Ca2+ intracelular en el tejido pancreático, determinar los niveles de factores apoptóticos regulados por las vías de señalización UPR en el tejido pancreático en relación con la muerte de las células beta del páncreas.

Ratas Wistar machos y hembras (10–12 semanas de edad, 200–250 g) se mantuvieron en una habitación con temperatura controlada (22 ± 2 °C) con un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h y su alimento (gránulos estándar, Pars Company, Teherán, Irán) contenía 2 g% de aceite de soja, que aportaba 4,75% Kcal como grasa; 17,5 g% de proteína, que aportaron 18,48% Kcal; Se proporcionaron 72,72 g% de carbohidratos, que aportaron el 76,77% de Kcal y agua ad libitum (es de destacar que los grupos experimentales estuvieron privados de comida y agua en los días de prueba). El apareamiento ocurrió durante la noche con dos hembras y un macho en una jaula, la preñez se confirmó con base en la presencia de espermatozoides en el frotis vaginal a la mañana siguiente y se consideró como día gestacional 0 (GD0). Los métodos del presente estudio se informaron de acuerdo con las pautas ARRIVE62. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la guía publicada anteriormente para el cuidado y uso de animales de laboratorio (NIH Publicación No. 85-23, revisada en 1996) y aprobados por el Comité de Ética del Centro de Investigación de Fisiología, Universidad de Ciencias Médicas de Tabriz, Tabriz. , Irán (IR.TBZMED.REC.1397.336) y Comité de Ética de la Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti, Teherán, Irán (IR.SBMU.MSP.REC.1400.300).

Se asignaron ratas presa a los grupos experimentales que constaban de siete grupos de estrés y un grupo de control. Las madres fueron expuestas a estrés variable durante 21 días consecutivos antes del empadre (durante el período previo al embarazo), y/o durante los períodos de embarazo y lactancia. Después del parto, los cachorros de cada grupo se mantuvieron con sus madres. La Tabla 1 mostró el tamaño de la camada, los porcentajes de cachorros machos por camada y la muerte en cada grupo. Todos los experimentos se realizaron en el día postnatal (DPN) 64 (28 ratas/grupo). La figura 9 representa el diseño experimental de este estudio.

Procedimientos experimentales a lo largo del experimento.

Después de la primera y última exposición al estrés, se tomaron muestras de sangre de madres y crías (PND-1 y PND-21) utilizando el método de punción retroorbital para medir los niveles de corticosterona en plasma. Fueron destetados el día PND-23, luego los cachorros machos de cada camada (hay diferencias de sexo en la aparición de trastornos metabólicos en comparación con las hembras, y los machos son más susceptibles a los trastornos metabólicos inducidos por los desafíos ambientales63, por lo tanto, este estudio examinó la descendencia de ratas macho para indicar las alteraciones metabólicas debidas al estrés materno) se asignaron al azar en ocho grupos de acuerdo con el estrés materno de la siguiente manera: grupo CTRL; los hijos de madres de control que no estuvieron expuestas a ningún estrés, grupo PPPLS; los hijos de madres que estuvieron expuestas a estrés durante los períodos de pre-embarazo, embarazo y lactancia, grupo PPS; los hijos de madres que estuvieron expuestas a estrés durante el período previo al embarazo, grupo PS; los hijos de madres expuestas a estrés durante el embarazo, grupo LS; los hijos de madres que estuvieron expuestas a estrés durante el período de lactancia, grupo PPPS; los hijos de madres que estuvieron expuestas a estrés durante los períodos de pre-embarazo y embarazo, grupo PLS; los hijos de madres expuestas a estrés durante el embarazo y la lactancia, grupo PPLS; los hijos de madres que estuvieron expuestas a estrés durante los períodos previos al embarazo y la lactancia. Desde el destete, las crías machos se alojaron por separado (tres por jaula) y tuvieron libre acceso a una dieta normal hasta el día experimental. En la edad adulta joven (PND-64), en la descendencia de todos los grupos de estudio, después de una noche en ayunas, se tomaron muestras de sangre para medir los niveles de glucosa e insulina en plasma, así como los índices HOMA-IR y Matsuda, luego la prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) fue realizado. Finalmente, los animales fueron decapitados para extirparles el páncreas con el fin de aislar los islotes y evaluar la secreción de insulina estimulada por glucosa junto con el contenido de insulina, los niveles de proteína y ARNm de WFS1, Bip, Chop y GR y la metilación del ADN del gen WFS1 y WFS1. , Niveles de proteína Bip y Chop del retículo endoplásmico rugoso.

Las presas de diferentes grupos de estrés fueron sometidas a estrés variable durante períodos específicos según su agrupación. El paradigma de estrés variable se utilizó para prevenir la posible habituación a un estresor homotípico (mismo) repetido. Los estresores se aplicaron durante el ciclo de luz en diferentes momentos del día (de 8 a 10 a. m. o de 14 a 16 p. m.). Se sabe que todos los factores estresantes utilizados inducen respuestas endocrinas en ratas macho. Además, debido a que la duración de la exposición al estrés en este estudio fue larga (3 semanas antes del embarazo, 3 semanas durante el embarazo y 3 semanas durante los períodos de lactancia), hemos aplicado estrés psicológico con diferentes intensidades que la madre puede tolerar y que tampoco se adaptan. lo. Los factores estresantes fueron los siguientes: (1) cilindro de plexiglás transparente (9,5 × 20 cm, 60 min); (2) retenedor de malla de alambre (4 × 8 cm, 60 min); (3) decapiCone Restrainer (pequeña bolsa de plástico con un agujero en el extremo por el que solo puede pasar la cabeza de la rata, 60 minutos); (4) estrés social (mover los animales a una nueva jaula con animales desconocidos, 60 min); (5) estrés de natación (tanque transparente, 18 × 40 cm, que contiene 12 cm de agua 23 ± 2 °C, 15 min); (6) agitación (alta velocidad, 20 min); (7) cortar la cola (1/3 terminal de la cola, 10 min); (8) luz brillante (tres veces, lámpara de 100 W, 10 min)54,64,65.

Se recolectaron muestras de sangre de las madres después de la primera y la última exposición al estrés y también de las crías adultas de cada grupo en PND64 utilizando el método de punción retroorbital. Las crías fueron decapitadas en PND1 y se recogió la sangre del tronco. En todas las muestras de sangre, la sangre se recogió después de anestesia con isoflurano (6,5 ml/l/kg de isoflurano/volumen del desecador/peso corporal de la rata) (Baxter, EE. UU.)66 después de una noche de ayuno. Las muestras de sangre se recogieron en microtubos heparinizados (5000 UI/mL, Caspian Tamin, Rasht, Irán, 10 µL/mL) y se centrifugaron a 664 × g a 4 °C durante 10 min. Luego, el plasma se almacenó a –80 °C hasta la medición de corticosterona. Los niveles plasmáticos de corticosterona se midieron utilizando el kit ELISA de corticosterona de rata (ZellBio GmbH, Ulm, Alemania). (Detección mínima: 0,9 nmol/l). Los coeficientes de variación intraensayo (CV) fueron del 6,4 %.

Después de ayunar durante la noche en PND64, se administró un bolo de solución de glucosa (% 20 en agua destilada, 2 g/kg de peso corporal) (Merck, Alemania) a ratas adultas por sonda oral y se recolectaron muestras de sangre a 30, 60 y 120 min después de la carga de glucosa para evaluar las concentraciones plasmáticas de glucosa e insulina67. Los niveles de glucosa e insulina en plasma se determinaron utilizando el método de glucosa oxidasa (Pars Azmoon Co., Teherán, Irán) y el método de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (kit ELISA de insulina de rata; ZellBio GmbH, Ulm, Alemania) respectivamente. (Detección mínima: 1 mg/dl y 0,1 mIU/L respectivamente). Los coeficientes de variación intraensayo (CV) fueron del 2,1 % y del 5,1 %, respectivamente.

La resistencia a la insulina se evaluó en ayunas calculando la evaluación del modelo de homeostasis de acuerdo con la siguiente fórmula:

HOMA-IR = Glucosa en ayunas (mmol/l) * Insulina en ayunas (µU/ml)/22,5

La sensibilidad a la insulina se calculó usando todos los puntos de tiempo GTT en la siguiente fórmula:

ISI (Matsuda) = 10,000 /√ [(Gayuno × Iayuno) × (media de GGOTT × media de IOGTT)]

Donde Gfasting es la glucosa plasmática en ayunas expresada como mg/dl, Ifinging es la insulina plasmática en ayunas expresada como μU/ml, la media GOGTT es la concentración media de glucosa plasmática después de la carga de glucosa y la media IOGTT es la concentración media de insulina después de la carga de glucosa68.

El aislamiento de los islotes se realizó mediante la técnica de colagenasa de Lacy y Kostianovsky (1967) 69 con una ligera modificación 70 (consulte los detalles en Método complementario).

La secreción de insulina estimulada por glucosa y el contenido de insulina se evaluaron en concentraciones de glucosa de 5,6 y 16,7 mM70 (consulte los detalles en Método complementario).

Se extrajeron vesículas rugosas derivadas de RER de células pancreáticas de rata mediante el método ligeramente modificado71 descrito por Kan et al. (1992). Brevemente, las ratas de cada grupo (8 ratas/grupo) se anestesiaron con isoflurano y se decapitaron. Luego, se extrajeron sus páncreas y se homogeneizaron en 30 ml de una solución de sacarosa helada (0,25 M) a 630,8 × g utilizando un homogeneizador eléctrico Potter (Potter-Elvehjem Homogenizer, Irán). A continuación, el homogeneizado se filtró a través de un filtro quirúrgico hecho de tela de algodón. Al agregar una solución de sacarosa (0,25 M) helada, el homogeneizado alcanzó un volumen de 60 ml y se centrifugó a 1881,33 × g durante 13 min. Posteriormente, el sobrenadante se centrifugó a 4957,87 × g durante 14 min y a 7923,73 × g durante 67 min, a 4 °C (Beckman modelo J-21B, EE. UU.). El sedimento se disolvió en 9 ml de sacarosa helada (2 M) y se transfirió a un homogeneizador de vidrio para homogeneizarlo manualmente de 20 a 25 veces. Posteriormente, la suspensión obtenida se centrifugó a 12.129,07 × g durante 67 min en un gradiente de sacarosa (que incluía solución de sacarosa 1 M y 2 M) y el precipitado resultante se disolvió en 20 ml de pirofosfato de imidazol de sacarosa (sacarosa 0,25 mM, imidazol 3 mM, pirofosfato de Na 0,5 mM). Luego se centrifugó a 8941,87 xg durante 47 min y se repitió tres veces. Finalmente, el precipitado resultante (vesículas RER) se disolvió en 1 ml de sacarosa imidazol (sacarosa 0,25 mM, imidazol 3 mM) a una concentración final de 7 mg/ml y se almacenó en alícuotas de 10 µl, pH 7,4, a -80 °C hasta siendo utilizado.

Los niveles de proteína se analizaron mediante transferencia Western (consulte los detalles en Método complementario). En este estudio se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios; WFS1#26110; Laboratorio de San Juan, Bip #21685; Abcam, Chop #11419; Abcam, GR n.º 223138; Abcam, β-actina #8226; Abcam, Calnexina #22595; Abcam.

Para determinar los niveles de ARNm de Bip, Chop, WFS1 y GR en tejido pancreático, se utilizó el método de PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR). Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 2 (consulte los detalles en el Método complementario).

Se realizó el método de PCR específico de metilación (MSP) para evaluar las diferencias de metilación en sitios CpG específicos del gen WFS1 basado en el tratamiento con bisulfito de DNA72.

El ADN genómico del tejido pancreático se extrajo mediante el método de fenol-cloroformo. Brevemente, se agregaron 300 μl de tampón de lisis (que contiene: sacarosa, 0,32 M; Tris, 10 mM; MgCl2, 5 mM; y SDS, 1 %) al tejido y se incubó a 40 °C durante 20 min, luego se añadieron 300 μl de Se añadieron solución de fenol y cloroformo. Después de centrifugar a 1770,67 × g durante 5 min, el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio que contenía acetato de sodio 0,3 M y alcohol absoluto (Merck, Alemania). Luego, la solución de ADN se incubó a -20 °C durante 2 h. Después de otro paso de centrifugación (30 min a 2877,3 × g) y de la adición de 100 μL de EtOH al 70 %, el tubo de ADN se secó al aire y se resuspendió en 30 μL de ddH2O. La concentración y la pureza del ADN se determinaron utilizando un espectrofotómetro Nano drop (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). El ADN se modificó por bisulfito utilizando el kit EpiTect Bisulfite Conversion (QIAGEN), según protocolo del fabricante. Brevemente, se mezclaron 500 ng de ADN (500 ng/ml) con 85 μL de mezcla de bisulfito, 35 μL de tampón protector de ADN y se ajustó a un volumen de 140 μL con agua libre de nucleasas. Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclo: 95 °C durante 5 min, 60 °C durante 25 s, 95 °C durante 5 min, 60 °C durante 85 min, 95 °C durante 5 min y 60 °C durante 175 min. Luego, el ADN modificado se lavó repetidamente con tampones (BW, BD, BL y EB) y posteriormente se centrifugó a 2656 × g durante 1 min, finalmente se almacenó a -20 °C.

Se diseñaron juegos de cebadores metilados (M) y no metilados (U) para MSP utilizando el software Meth Primer, las secuencias de los cebadores se enumeran en la Tabla 3. Las condiciones de amplificación fueron 95 °C durante 5 min (desnaturalización inicial) seguido de 40 ciclos de 95 °C por 30 s (desnaturalización), 58 °C por 30 s (recocido), 72 °C por 30 s (extensión); y 7 min como extensión final a 72 °C. Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando un termociclador BIOER 9500 (Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd., Binjiang, China). Los productos de PCR se resolvieron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%. Para determinar el grado de metilación del gen WFS1 se utilizó el software Image J y se evaluaron las intensidades de las bandas.

Los datos se mostraron como media ± error estándar de la media (SEM). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía (considerando el estrés como un factor independiente) y ANOVA de medidas repetidas de dos vías (considerando el tiempo como un factor repetido y el estrés como un factor independiente) según corresponda y seguido de una publicación de Tukey prueba hoc utilizando el paquete de programas GraphPad Prism (Versión 6). El valor de p por debajo de 0,05 se consideró como el nivel de significancia.

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Los resultados descritos en este artículo formaron parte de la tesis de un estudiante de doctorado y recibieron el apoyo de una subvención del centro de investigación aplicada a fármacos de la Universidad de Ciencias Médicas de Tabriz (subvención n.º 60218) y una subvención del Departamento de Investigación de la Facultad de Medicina de la Universidad Shahid Beheshti de Ciencias Médicas (Beca No 27310).

Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad de Ciencias Médicas de Tabriz, PO Box: 5166614756, Tabriz, Irán

Mina Salimi y Rana Keyhanmanesh

Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina, Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti, PO Box: 19615-1178, Teherán, Irán

Farzaneh Eskandari, Fateme Binayi, Afsaneh Eliassi y Homeira Zardooz

Centro de Investigación de Neurofisiología, Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti, Teherán, Irán

Afsaneh Eliassi y Homeira Zardooz

Centro de Investigación de Biología Celular y Molecular, Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti, Teherán, Irán

Hossein Ghanbarian y Mohamad Eftekhary

Centro de Investigación Endocrina Celular y Molecular, Instituto de Investigación de Ciencias Endocrinas, Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti, Teherán, Irán

Mehdi Hedayati

Centro de Investigación de Electrofisiología, Instituto de Neurociencia, Universidad de Ciencias Médicas de Teherán, Teherán, Irán

Javad Fahanik-babaei

Centro de Investigación Aplicada a Medicamentos, Universidad de Ciencias Médicas de Tabriz, Tabriz, Irán

Rana Keyhanmanesh

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Correspondencia a Rana Keyhanmanesh o Homeira Zardooz.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Salimi, M., Eskandari, F., Binayi, F. et al. El estrés materno indujo el estrés del retículo endoplásmico y deterioró la secreción de insulina de los islotes pancreáticos a través de la regulación al alza del receptor de glucocorticoides en crías de ratas macho adultas. Informe científico 12, 12552 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16621-5

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Recibido: 26 febrero 2022

Aceptado: 12 julio 2022

Publicado: 22 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16621-5

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